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简化基因组甲基化测序(RRBS)

项目介绍

简化基因组甲基化测序 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS) 是通过限制性酶切的方法
富集基因组DNA上富含CCGG位点的片段,经Bisulfite处理和高通量测序技术
进行基因组CpG富集区域内的单碱基分辨率的甲基化测序。
相对WGBS而言RRBS技术作为高性价比的甲基化测序方案,
测序量大幅减少,在大规模临床样本研究中具有很不错的应用价值。


技术优势

高性价比DNA甲基化测序方案

具有Bisulfite测序单碱基分辨率

富集CpG岛和启动子区域,测序目标性强

适合动物物种,哺乳动物可以检测高达0.5M以上CpG位点

多样本的覆盖区域重复性可达80%以上


科学方案设计

从项目背景了解、协助方案设计、实验材料选取、建库测序,到数据分析,

每个项目有特定的科学问题;需要专业、有价值的建议;科学、缜密的设计;

及时高效的沟通;以保障高质量研究成果。

信息分析

基于简化基因组范围的甲基化分析,数据质控、5mC Calling, 

5mC在基因组、染色体、功能元件上的分布

多样本甲基化差异聚类、差异甲基化DMR鉴定及相关基因的功能分析,

结合项目背景和科学问题的数据亮点挖掘。

分析内容

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用心服务每一个项目

最早开发简化基因组甲基化测序技术方法的团队之一

已完成人、小鼠、大鼠、猪等多种哺乳动物简化基因组甲基化测序分析

助力客户在EpigeneticsEpigenomicsBMC genomicsBMC Genetics等杂志发表多篇论文

专业的技术支持,严格的实验把关,丰富的项目经验,高效的沟通机制,用心服务好每一个项目




简化基因组甲基化测序(RRBS)案例展示

案例分析一 (团队成员发表)

微生物的定植对肠道早期免疫和代谢相关基因DNA甲基化的影响

Early microbial colonization affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19.(IF=5.415)

一、研究背景

表观遗传学调控可能在介导微生物-宿主相互作用,以及出生后肠道基因表达对细菌定植的适应性中发挥着重要作用,在早产儿的肠道中表现可能更为突出,因为未成熟的小肠对细菌的入侵尤为敏感。在本研究中,我们以早产幼猪为模型,比较了正常(CON) 和口服抗生素处理过的(AB)早产猪的肠道DNA甲基化和微生物菌群的差别,以探究肠道早期微生物的定植如何通过表观机制对早产儿的短期和长期的肠道健康的重要作用。

二、方法流程

1、取材:三头母猪产的14头早产猪的全肠组织

对照组:CON group, n=7

抗生素处理组:AB group, n=7

2、测序:简化基因组甲基化测序(RRBS)

         微生物16S测序

3、验证:高通量BSP:差异甲基化基因

RTq-PCR: 基因表达差异

4、功能:

三、研究结果

1) 抗生素处理减少了肠道细菌密度以及多样性(~100),但提高了对坏死性肠结肠炎(NEC)的抵抗力;

2) 抗生素处理改变了肠道组织DNA甲基化修饰的水平;

3) 与先天免疫应答、吞噬、内皮稳态和组织代谢等相关基因(CPN1C3LBPHIF1AMicroRNA-126PTPRE)DNA甲基化和表达存在显著的差异,而且这种差异早在NEC病变之前就已形成。

四、研究结论

新生的未成熟小肠DNA甲基化的改变受到了肠内细菌定植的影响,这种有赖肠道菌群的表观遗传修饰参与调控肠道免疫、血管完整性和营养代谢,可能对早产儿的短期和长期的肠道健康至关重要。

  

 
     图1. 菌群在肠道内的定植对DNA甲基化的影响                         图2. 甲基化组和蛋白组网路分析                                         图3. 缺氧与血管功能相关基因的表达  

 



 

案例分析二(团队成员发表)

Ph+慢粒白血病甲基化研究

Next-generation sequencing identifies major DNA methylation changes during progression of Ph+ chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2016;30(9):1861-8. (IF=11.702)

一、研究背景

DNA甲基化对Ph+慢粒白血病(CML)发生、发展的影响尚不清楚。本文通过简化基因组甲基化测序(RRBS)的方法研究慢性期(CP-CML)、加速期(AP-CML)和急变期(BC-CML)CML患者和对照组CML的甲基化变化,以探索CML发病机制及为揭示晚期CML治疗的新靶点提供新的策略。

二、方法流程

1、取材:31CML样本及5个对照样本的单核细胞

    CP-CML(n=17), AP-CML(n=5), BC-CML(n=9),

对照组Ctrl group (n=5)

2、测序:简化基因组甲基化测序(RRBS)

         转录组测序(RNA-Seq)

3、验证:MS-HRM:验证差异甲基化基因

qRT-PCR: 验证基因表达差异

4、功能:

三、研究结果

1) 与正常对照组相比,CP-CML患者仅检测到~600个差异甲基化的CpG位点,而BC-CML患者则检测到~6500个差异甲基化的CpG位点;

2) 在大多数受影响的CpG位点, 甲基化水平增加;

3) 在进展到AP-CML/BC-CMLCP-CML患者中, 鉴定了897个在进展期而不是在诊断时甲基化的基因;

4) 通过RNA测序和比较CP-CML样品,观察到BC-CML中许多甲基化基因的表达下调,其中一些是众所周知的肿瘤抑制基因或细胞增殖调控基因,并且通过表观药物(甲基化酶抑制剂)处理,观察到这些甲基化抑制基因重新表达。

四、研究结论

总之,研究结果显示CpG位点甲基化在慢性粒细胞白血病进展过程中明显增加,并可能为揭示晚期CML治疗的新靶点提供有用的基础。


      


               图1. 基于RRBS检测的CML 样本甲基化CpG统计                                                        2. 甲基化聚类及差异甲基化位点
 




                       
                        
图3. AP-CML和BC-CML中甲基化基因热图                                                                                     图4. 甲基化抑制表达的基因


简化基因组甲基化测序(RRBS)结果展示

外显子组测序

简化基因组甲基化测序(RRBS)常见问题

Q1:为什么RRBS主要应用于哺乳动物?

RRBSMspI酶切将CpG位点富集出来进行测序,该酶的酶切位点为CCGG,因此RRBS只能检测发生于CCGG /GGCC位点的胞嘧啶甲基化修饰现象。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上,而植物基因组甲基化位点广泛分布在CpG和非CpG位点(CHH,CHG),因此,RRBS主要运用于人、小鼠和DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上的哺乳动物,其它动物物种想做RRBS,最好先进行评估该物种基因组上CCGG位点特征。

Q2RRBS测序覆盖区域如何?

RRBS一般可以覆盖80%以上的CpG岛和Promoter(这注意:这个比例仅仅是针对数目,RRBS覆盖某个Promoter区域的5CG位点,即算覆盖该Promoter);而且与测序深度、测序质量等有关;

Q3:那些因素会影响大样本RRBS测序结果?

RRBS一般适合人、鼠等哺乳动物大样本甲基化研究,在做类似Case Vs. Control对比研究课题中,多样本测序覆盖区域的重叠比例很重要,这与样本DNA质量(要求DNA完整性好,而片段化的FFPE样本会差很多)、实验流程及测序深度、测序质量等都有关。


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